AVIPure® AAV9 亲和填料工艺开发指南

使用 AVIPure^® AAV9 亲和填料纯化 AAV9 的最佳条件需要根据每个 AAV9 衣壳的性质确定。作为初始条件，建议使用表 1 中总结的方法。为了确保每个循环的可比性，还建议在首次使用填料之前执行消毒步骤。该步骤应与填料储存前使用的 CIP 步骤相同。

对于未浓缩的料液中纯化 AAV9，可以使用上表中描述的方案，其中保留时间可以缩短至 1 分钟。使用 AVIPure^® AAV9 填料获得的典型色谱图如图 1 所示。非常尖锐的洗脱峰是该填料的特征之一。

图 1. 使用载有含有 AAV9 衣壳的非浓缩裂解液的 AVIPure^® AAV 9 填料获得的色谱图示例。上样量：250 CV，2.5 x 1011 vp/mL，保留时间 1 分钟。

图 2 显示了 AVIPure^® AAV9 亲和填料纯化的 AAV9 衣壳时获得的流穿曲线。流穿曲线对比了：1 分钟和 4 分钟保留时间，以及代表未浓缩和浓缩上样的两种样品浓度。表 2 列出了从图 2 中提取的 10% 流穿时的动态结合能力，范围从 2.0 × 1017-7 × 1017vp/L不等。AVIPure^® AAV9 亲和填料在低保留时间和低衣壳浓度下的高 DBC 可以实现在亲和捕获之前无需浓缩步骤即可处理裂解物，减轻超滤过程中潜在的产量损失，缩短整体处理时间。

图 2. 保留时间和进料浓度对 AVIPure^® AAV9 亲和填料结合能力的影响。实线和虚线分别代表在1分钟和4分钟停留时间获得的数据。红色代表低进料浓度的数据，蓝线代表高浓度。

表 2. AVIPure^® AAV9 填料在不同保留时间获得的 10% 流穿时的动态结合载量

确定最合适的洗涤和洗脱条件将分别确保亲和步骤的高纯度和高产率。如果使用 AVIPure^® AAV9 亲和填料的推荐洗脱条件（50 mM 甘氨酸、150 mM 氯化钠、pH 2）无法完全洗脱吸附的病毒，则可以采用柱或微量滴定板形式进行筛选研究。下面，我们展示了微量滴定板形式的洗涤和洗脱缓冲液筛选研究的示例。

将 5 微升填料分配到含有 100 µL 平衡缓冲液的微量滴定板的孔中。过滤板并添加 250 µL 含有 1 × 10¹³ vp/mL 的料液。孵育 60 分钟后，过滤板并添加 100 µL 洗涤（平衡）缓冲液。孵育 5 分钟后，过滤板并执行另一个清洗周期。第二次洗涤循环过滤后，添加 100 µL 洗脱溶液。孵育5分钟并过滤板，收集滤液。执行另一个洗脱循环。通过添加 40 µL 1 M Tris Base、0.5 M NaCl、pH 9 来中和洗脱组分。使用 AAV9 ELISA 分析 AAV 衣壳的中和洗脱液。

图 3. 洗脱条件筛选方案的可视化表示。

AVIPure^® AAV9 亲和填料基于 50 µm 高度交联的琼脂糖基架。装柱高度在 5 到 20 cm 之间的压力流量曲线示例显示在图4。建议选择直径更宽，柱高更矮的装柱方式。对于 5 厘米和 20 厘米床高，建议的最短保留时间分别为 1 分钟和 5 分钟。如果在没有事先浓缩步骤的情况下加载病毒颗粒，建议缩短保留时间。

图 4. 30 cm 直径层析柱中 AVIPure^® AAV9 Affinity Resin 基架的压力流量数据，装柱高度为 20 cm（红色方块）、15 cm（橙色三角形）、10 cm（蓝色圆圈）和 5 cm（实线，模拟）数据）压缩系数为 1.15。数据由 Purolite^® Ltd 提供

在各种 CIP 试剂中，NaOH 是生物工艺CIP方案的首选，因为它成本低、易于处理，并且能够有效的溶解沉淀的蛋白质、去除核酸、皂化脂肪和灭活内毒素。

AVIPure^® AAV9 亲和填料是一种耐碱填料，可使用浓度高达0.5 M NaOH进行再生。下面描述了使用真实料液和 0.5 M NaOH 作为 CIP 溶液的填料寿命循环研究。

图 5. AVIPure^® AAV9 寿命研究概要。

该研究是通过每 5 个cycle向层析柱上样一次实际料液，在研究结束时，填料暴露于 0.5 M NaOH 中 15 小时。在 30 个 CIP 循环（每个循环暴露于 0.5 M NaOH 30 分钟）后，填料仍保留 ≥ 90% 的结合能力。HCP 和 HDNA 的去除也不受延长 NaOH 暴露的影响，并且 HCP 和 HDNA 分别保持在 5 个对数级和 3 个对数级的平均降低水平。在研究过程中，还监测了每个循环的柱压降，但没有观察到压降的变化。

图 6. AVIPure^® AAV9 Affinity Resin 寿命研究的循环 1（红色曲线）、循环 16（蓝色曲线）和循环 31（绿色曲线）的色谱图。

下面提供了 AVIPure^® AAV9 亲和填料的推荐 CIP 方法。

1. 5 倍柱体积的平衡缓冲液清洗

2. 使用 0.5 M NaOH 执行 CIP ：

a. 3 分钟保留时间，3 CV

b. 静止保持，总接触时间为 15 分钟。

c.   3 分钟保留时间， 2 CV

3. 使用至少 5 倍柱体积的平衡缓冲液重新平衡层析柱。

当然通过进一步优化的 CIP 方法，AVIPure^® AAV9 亲和填料的使用寿命还可以进一步延长，甚至超过上述结果中显示的 30 个循环。根据样品的性质，不同的 CIP 方案可以提供填料性能和寿命的最佳平衡。例如，每个循环接触 0.1 M NaOH 15 分钟，每 10 个循环或每批次结束时接触 0.5 M NaOH 30 分钟，将进一步延长填料寿命。建议在长期储存之前使用 0.5 M NaOH 进行 CIP。

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